Dekoding av markører for hepatitt C

Hepatitt markører er fremveksten av ulike strukturer av sykdommen. Den aktuelle virussykdommen er vanskelig å behandle. Hepatitt påvirker fordøyelsesorganene.

Laboratoriediagnose

Leger skiller mellom 2 former for sykdommen:

akutt - hepatitt B og A; kronisk hepatitt C.

Behandlingen utføres etter undersøkelse av pasienten. Den viktigste måten å diagnostisere hepatitt C, B og A er å gjennomføre blodprøver for virale hepatittmarkører. Produksjonen av immunoglobulin oppstår når antigener kommer inn i menneskekroppen (kjerne, komponenter, hepatitt B, C eller A-konvolutt). Ved den første fasen av sykdommen produseres ikke-spesifikke antistoffer. Deretter produseres visse immunglobuliner til den tilsvarende komponenten av viruset. For å diagnostisere sykdommen, bruker leger dem i klasse G og M. Hvis IgM oppdages i blodet, oppstår en akutt prosess i pasientens kropp. Klasse G immunoglobuliner indikerer en sykdom. Slike antistoffer er hovedkriteriene for hepatitt E og A. Med deres hjelp kan legen gjøre en nøyaktig diagnose. Hovedtegnene til akutt form av leger inkluderer:

tilstedeværelsen av overflateantigenet HbsAg; HBeAg protein; immunoglobulin anti-HBc.

For å oppdage hepatitt C er det tatt hensyn til forekomsten av følgende antigener:

HCV IgM; HCV Core IgM; HCV NS.

For å gjøre en nøyaktig diagnose utfører legene en omfattende diagnose. For å oppdage viral hepatitt B og C blir antistoffer, markører og antigener dechifrert. For å diagnostisere den akutte formen, utfør følgende laboratorietester:

Blodprøve for markører; PCR.

Hepatitt symptomer

Med en sterk immunitet, avsluttes den akutte sykdomsformen med fullstendig gjenoppretting av pasienten. Hvis sykdommen fortsetter uten symptomer, kan den akutte formen forvandles til et kronisk stadium. I dette tilfellet har pasienten følgende symptomer:

leveren øker; smertsyndrom; gulsott; kløe i huden; svakhet; kvalme; rape.

Den kroniske graden av sykdommen fører til gradvis død av leveren. Komplikasjoner eksperter inkluderer cirrhosis. Symptomer på hepatitt C uttrykkes 2-14 uker etter infeksjon:

dårlig appetitt; svakhet; forstyrret søvn; tyngde i magen; utslett.

Disse symptomene vises i 1 uke. Deretter kommer den icteric perioden. Cal får en lys nyanse. Det er smerte i leddene. Denne perioden varer 3-5 uker. Dekoding av resultatet kan vise tilstedeværelsen av et inaktivt virus eller en kronisk form av sykdommen. For en nøyaktig diagnose utføres en ytterligere undersøkelse:

ALT; kvantitativ PCR; biopsi.

Ved hjelp av dekoding av den siste undersøkelsen, bestemmer legen nivået av leverenzymer, vurderer stadiet av den inflammatoriske prosessen. ALT og AST er hepatocyt enzymer. Hvis cellene er skadet, går de utenfor. Ved hjelp av et blodtestutskrift vurderes nivået av hepatittaktivitet, sykdomsstadiet og graden av leverskade. Hvis nødvendig, bruk ikke-invasive metoder for å vurdere tilstanden.

I leverbiopsi tar en spesialist et organvev med en nål (materialvekt 0,5 g). For en slik undersøkelse brukes lokalbedøvelse. Materialet studeres under et mikroskop. Med denne analysen får legen nøyaktig informasjon om graden av aktivitet av hepatitt B.

Evaluering av resultater

Tabellen over viral hepatitt markører gjør det mulig å avdekke avvik fra de oppnådde dataene fra normen.

Positive HBs indikerer tilstedeværelsen av hepatitt B og C. Hvis testresultatet er negativt, er det ingen HBV i blodet. Antistoffer mot overflateantigenet presenteres i form av beskyttende strukturer. De produseres når de injiseres i kroppen av det andre antistoffet. En positiv test indikerer at personen er beskyttet mot viruset av følgende grunner:

vaksinasjon; selvinfeksjonskontroll.

RÅDGIVER! Hvordan lagrer du leveren din?

Nikolay Zakharov, Lektor, PhD, Hepatolog, Gastroenterolog

"Levende celler av dihydroquercetin er den sterkeste hjelperen til leveren i tilfelle hepatitt. Den er bare utvinnet fra harpiks og bark av villmark. Jeg vet bare ett stoff der maksimal konsentrasjon av dihydroquercetin. Dette er... "

Anti-HBc er produsert som respons på nærvær av et kjerneantigen i kroppen. Resultatet av denne testen avhenger av dekoding av anti-HBs og HBsAg. Når et positivt resultat oppnås, foreskrives et behandlingsforløp (hvis pasienten ikke har vært infisert tidligere). For å oppdage en akutt infeksjon utføres en IgM anti-HBc-analyse. Et positivt resultat indikerer en infeksjon i pasientens kropp i løpet av de siste 6 månedene eller en forverring av hepatitt C.

Med den aktive formen av sykdommen anbefales det å passere analysen av HBeAg. Hvis testen viste et positivt resultat, er pasienten en bærer av sykdommen. Samtidig er det høy infeksivitet i blodet. Anti-HBe er et protein som dannes i menneskekroppen som respons på E, et antigen av den akutte sykdomsformen.

Et positivt resultat indikerer utviklingen av lavaktivitets hepatitt C på grunn av lave nivåer av HBV i blodet. Ellers starter i pasientens kropp prosessen med konvalescens.

En positiv HBV-DNA-test indikerer aktiv multiplikasjon av hepatitt B-viruset. Pasienten er potensielt farlig for andre mennesker. Hvis pasienten lider av hepatitt C, indikerer et positivt resultat fra en slik studie leverskade.

Og litt om hemmelighetene...

Ikke mange vet at hepatitt kan herdes hjemme!

Heling av leversykdommer er mulig uten kirurgiske inngrep, langvarige kurs av antibakteriell og rehabiliteringsbehandling, etc.!

For å gjøre dette trenger du et verktøy med høyt innhold av naturlig dihydroquercetin. Resultatet av behandling overrasker selv erfarne leger. Levende celler utvinnes bare fra harpiksen og barken til villmarken.

Leserne våre har bekreftet effektiviteten av denne metoden for behandling! Olga Krichevskaya forlot hennes anmeldelse om behandling av hepatitt her >>

Sykdommer i indre, vitale organer er alltid skummelt og ofte dårlig tolerert av kroppen. En person er mer sannsynlig å henvende seg til en lege hvis det er visuelle symptomer (rødhet, etc.), men hepatitt i begynnelsen er asymptomatisk. De første tegn på sykdommen oppstår når sykdommen utvikler seg. For diagnose brukte markører av viral hepatitt. For å gjøre analysen, må du konsultere en lege og ta en blodprøve for undersøkelse.

analyser

Ved hjelp av blodprøver begynner diagnostiske prosedyrer av nesten hvilken som helst sykdom. Diagnostiseringsprosessen kan inneholde en eller flere kjente markører. Som regel består en standardstudie av et minimumssett av indikatorer. Hvis testen er positiv, utnevnes flere studier som gjør det mulig å fastslå ikke bare tilstedeværelsen, men også skjemaet og scenen av sykdommen.

En bestemt form for hepatitt er autoimmun. Under utviklingen av sykdommen frigjør menneskekroppen spesielle antistoffer som angriper friske leverceller. Årsaken til denne patologiske prosessen er for tiden ukjent. Samtidig er autoimmun hepatitt i totalt 25% av tilfellene helt asymptomatisk og diagnostiseres først etter at levercirrhose har begynt. ASMA og AMA brukes som markører for autoimmun hepatitt. Begge typer antistoffer eller en av dem kan detekteres hos en pasient.

Infeksjonsmetoder

Hovedmodus for overføring av hepatitt er oral-fekal, noe som tyder på at viruset er tilstede i den infiserte massens fekale masse. Kontakt av en sunn person med pasientens avfallsprodukter er også nødvendig. I motsetning til populær tro kan du få hepatitt, ikke bare gjennom et besøk på toalettet. Resten av viruset finnes på rullejern i offentlig transport, husholdningsvarer, magasiner på offentlige steder, etc. Viruset kommer i hendene på en sunn person, og deretter inn i munnhulen. Derfor er det viktig å observere hygiene og vaske hendene med såpe før du spiser.

I land som har problemer med overholdelse av sanitære standarder, kan hepatitt være epidemiologisk i naturen og overføres gjennom vann.

Det finnes andre måter å smitte på:

Sykdomstypene B, C, D, G kan overføres under ubeskyttet sex. Seksuelt aktive mennesker samt sexarbeidere er i fare. Legene anbefaler testing for deteksjon av hepatittmarkører hver 3. måned. Ved kirurgisk operasjon som bruker donert blod, kan 2% av det biologiske materialet inneholde hepatittviruset. Derfor, før transfusjon, er det nødvendig å foreta ytterligere forskning av materialet. Piercing, tatovering og andre nålbehandlinger kan bære infeksjonen. Moderne utstyr og vedlikehold av sanitære standarder i salonger bidrar til å unngå spredning av sykdommen. Den vertikale infeksjonsmåten (fra mor til utviklende foster) blir sjelden observert av leger. Men i tilfelle da kvinnen ble syk med en akutt form for viruset i 3. trimester, øker sannsynligheten for infeksjon av fosteret betydelig. I nesten 40% av tilfellene med infeksjon med viral hepatitt, er kilden ukjent.

Typer A og E

En form for type A sykdom, en type virus hepatitt som er den vanligste. En blodprøve for markører av viral hepatitt type A bør utføres etter inkubasjonsperioden for viruset. Før de første symptomene på sykdommen vises, kan det ta fra 7 til 50 dager. Men hvis det har vært kontakt med en infisert person, og det er mistanke om overføring av viruset, anbefaler leger flere studier på forskjellige tidspunkter.

Den første vil bli holdt umiddelbart, sist etter maksimal inkubasjonsperiode.

Symptomene på sykdommen ligner forkjølelsen, ledsaget av en økning i kroppstemperatur og kulderystelser. Behandlingen er vanligvis vellykket, og ingen sykdom går raskt unna. Det er også alvorlige tilfeller når pasienten krever sykehusinnleggelse og innføring av spesielle legemidler for å opprettholde leveren, samt en reduksjon av virusets giftige virkning.

Typen av hepatitt E er svært lik i utseende og symptomer for å skrive A-virus. Ofte bruker diagnostikk markører til å identifisere begge typer for nøyaktig identifisering av viruset. Hepatitt E er mer alvorlig og svært farlig for kvinner i svangerskapet. Følgende markører brukes til diagnose.

IgM anti-HAV. Denne typen antistoff produseres når kroppen aktivt bekjemper et A-virus. En akutt form av sykdommen er diagnostisert. IgG anti-HAV. Type G antistoffer er tilstede i pasientens kropp hvis han har hatt en sykdom eller hvis hepatitt har blitt kronisk. IgM anti-HEV. En spesiell type antistoff som tilsvarer akutt viral hepatitt E. IgG anti-HEV. Vellykket herdet eller kronisk form for hepatitt E.

Typer B og D

Hepatitt B markører brukes til å diagnostisere akutte og kroniske former for sykdommen. Overføringen av hepatitt B kan forekomme fra pasient til pasient under seksuell kontakt. Også denne virale sykdommen overføres gjennom blod. Infeksjon fra mor til foster, overføring av virus gjennom injeksjoner, etc. er mulig. Symptomer på sykdommen begynner med mild sykdom, feber, leddsmerter.

Deretter forverres tilstanden, svakhet, kvalme og oppkast.

Forskning på hepatitt D markører er ofte foreskrevet i forbindelse med analyse for type B. Viral type D er en slags satellitt av en annen type sykdom som kompliserer behandling og provoserer utviklingen av komplikasjoner. For diagnostikk bruker flere unike typer markører. Dekoderingsresultater presenteres i tabellform.

Laboratoriediagnose av hepatitt C

MI Mikhailov, Institutt for epidemiologi og mikrobiologi. N.F. Gamalei RAMS, Moskva

Ved diagnostisering av "hepatitt C" bør følgende viktige faktorer vurderes:

  • aktivitetsindikatorer for "leveren" enzymer;
  • Tilstedeværelse eller fravær av markører av infeksjon med hepatitt C-viruset (HCV) og andre hepatotropiske virus;
  • data om epidemiologisk historie;
  • Resultatene av klinisk undersøkelse av pasienten. Bare en omfattende regnskapsføring av disse faktorene gjør det mulig å diagnostisere denne sykdommen med høy grad av pålitelighet. Laboratoriearbeideren må gi objektiv informasjon om det identifiserte spekteret av virale antigener og antistoffer, samt HCV RNA, slik at klinikeren, en blodtransfusjonstjenestearbeider og epidemiologen kan løse sine problemer. Ofte er det:
  • identifisering av personer med HCV for å redusere nivået av hepatitt C etter transfusjonen;
  • diagnose og skille mellom akutt og kronisk hepatitt C;
  • prognose av sykdommen;
  • utnevnelse, evaluering og prognose av effektiviteten av terapien;
  • studie av bredden av spredning av HCV i befolkningen og ulike grupper av befolkningen.
    I dette tilfellet er de viktigste arbeidsområdene som utføres av laboratoriepersonalet:
  • utvikling og utvelgelse av de mest informative metoder for å identifisere markører for HCV infeksjon;
  • fastsettelse av kriterier for en objektiv vurdering av de oppnådde resultatene
  • utvikling av optimale laboratorieforskningsalgoritmer;
  • implementering av et system for å forbedre kvaliteten på deteksjon av HCV infeksjonsmarkører.

    Basis for laboratoriediagnostisering av hepatitt C er kunnskap om HCV, replikering, informasjon om dynamikken i fremveksten og forsvinden av infeksjonsmarkører, samt moderne immunokjemiske og molekylærbiologiske metoder for påvisning av antigener, antistoffer og nukleinsyrer.

    Hepatitt C-viruset. HCV ble først identifisert i 1988, da en gruppe forskere ledet av M. Houghton og Choo Q.L anvendte nye molekylærbiologiske forskningsmetoder, klonet og sekvenserte virusgenomet [I]. En partikkel av hepatitt C-virus har en sfærisk form med en gjennomsnittlig diameter på ca. 50 nm [2,3]. Forsøk på å visuelt oppdage og studere strukturen av hepatitt C-viruset er gjort siden virusoppdagelsen, men det er fortsatt ingen veldokumenterte resultater av disse studiene, noe som kan skyldes vanskeligheten ved å samle viruspartikler i de nødvendige mengdene.

    VGS er det eneste medlemmet av Hepacivirus-slekten i familien Flaviviridae, som inkluderer virus som tyrediaravirus og svinepest (Pestivirus-genus) og gult febervirus, Denge-virus og GB-virus: GBV-A, GBV-B og GBV-C / HGV (slekt Flavivi-rus). Strukturen av hepatitt C-viruset kan representeres som følger (skjema nr. 1). Nukleokapsidet inneholder RNA i hepatitt C-viruset. Nedenfor er nukleokapsidet belagt med en lipidmembran med innkapslet i det innkapslede proteiner kodet av HCV RNA. Det virale genomet er representert ved et enkeltstrenget lineært RNA-molekyl med positiv polaritet, med en lengde på ca. 9.600 nukleotider. Organiseringen av HCV-genomet ligner på andre flaviviruser. Det skiller mellom to soner som koder for strukturelle og ikke-strukturelle (funksjonelle) proteiner. Generene som koder for strukturelle proteiner er lokalisert i 5'-regionen av virusgenomet og ikke-strukturelle i 3'-regioner. HCV-genet har en åpen leseramme (ORS), et enkelt polypeptid (ca. 3000 aminosyrer), som kuttes i strukturelle og ikke-strukturelle proteiner av virale og cellulære proteaser.

    Fig. 1. Strukturelle elementer av HCV

    Strukturelle proteiner inkluderer proteiner kodet av Core, El og E2 sonene av HCV RNA. Tre former for HCV C-protein ble påvist: full lengde (p21) med en molekylvekt på 21 kD, avkortet (p19) og form (p16) funnet i nukleolene av infiserte hepatocytter. På overflaten bærer C-protein forskjellige svært konserverte B-celleepitoper, hvis eksistens er ekstremt viktig for påvisning av antistoffer mot HCV ved laboratoriediagnose av hepatitt C.

    HCV RNA sonene El og E2 koder for proteiner med en molekylvekt på 31 og 70 kD. Disse proteiner har flere N-glykosyleringssteder; I E1-proteinet er opptil 6 slike steder definert, og i E2 - 11. I E2-delen er det informasjon om et lite protein - p7, som ikke finnes i virusets struktur.

    Betegnelsen av regioner som ligger nærmere 3'-enden av HCV RNA - som soner som bærer informasjon om virusets ikke-strukturelle proteiner, indikerer at disse proteinene ikke er strukturelle komponenter av viruspartikkelen. I den ikke-strukturelle sonen av HCV RNA er det seksjoner betegnet som: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A og NS5B. De fleste proteiner kodet av ikke-strukturelle soner av HCV RNA er nødvendige for virusreplikasjon.

    En komparativ analyse av nukleotidsekvensene av RNA av HCV-isolater oppnådd i forskjellige regioner i verden, og selv i løpet av sykdommen fra samme pasient avslørte hovedtrekk ved dette viruset - høy heterogenitet av RNA. Plasseringen av signifikant genetisk variabilitet av HCV RNA dannet grunnlag for teorier som forklarer: den langsiktige (noen ganger livslange) vognens bevegelse, den hyppige utviklingen av en kronisk sykdom, vanskeligheter med terapi og etablering av effektive vaksiner. De mest signifikante forskjellene i sekvensene av HCV RNA er konsentrert i den N-terminale delen av E2-regionen, som er betegnet som "hypervariabel region" (HVR) [4].

    For tiden er det identifisert 6 hovedgenotyper og over 100 HCV-undertyper. Genotypene 1a, 1b, 2a, 2b, 2c og Za utgjør mer enn 90% av HCV-isolatene fra Nord- og Sør-Amerika, Europa, Russland, Kina, Japan og Australia / New Zealand [5]. Genotyper 4, 5a og 6, registreres i Sentral-og Sør-Afrika og Sørøst-Asia. I Russland og CIS-landene er overlegenhet av genotype 16 registrert (ikke mindre enn 68,9%) [6,7]. Det antas at pasienter infisert med genotype 1 (spesielt 1c) reagerer verre på behandling enn pasienter infisert med andre genotyper av viruset.

    I en pasient sirkulerer HCV som en populasjon av viruspartikler hvor genomene avviger fra hverandre med 1-2% (av kvasespesifisitet) som følge av mutasjoner som akkumuleres under infeksjon og / eller inn i pasientens kropp under infeksjon. Disse mutantformene kan bidra til mer aktiv replikasjon eller kan bidra til at viruset unngår kroppens immunrespons og potensielt påvirker utfallet av akutt infeksjon, forskjeller i løpet av sykdommen og responsen på interferonbehandling [8].

    DEFINISJON AV ANTI-HCV. Etter oppdagelsen av HCV-viruset og å bestemme sin rolle i utviklingen av posttransfusjons hepatitt - "verken A eller B", var forskerne opptatt av å utvikle metoder som var i stand til å oppdage personer med HCV og egnet for diagnostisering av akutt og kronisk hepatitt C. Det ble funnet at HCV-antigener sirkulerer i ekstremt lave konsentrasjoner, og det er åpenbart at metodologinivået på slutten av 80-tallet i det 20. århundre, som ble brukt til å påvise virusantigener, var tydelig utilstrekkelig.

    I 1989 klonte en gruppe forskere fra Chiron Corporation, under ledelse av Q-L.Choo, HCV RNA og oppnådde immunoreaktive oligopeptider som reagerer med antistoffer som sirkulerer i blodet hos pasienter med kronisk hepatitt "verken A eller B". Disse oligopeptidene har blitt grunnlaget for diagnostiske legemidler for påvisning av antistoffer mot HCV. Dette bestemte den raske utviklingen i utvikling og kommersiell produksjon av diagnostiske produkter. Den viktigste metoden som brukes til å påvise anti-HCV, har blitt enzymbundet immunosorbentanalyse, som en metode som tilfredsstiller kravene til praktisk helsetjenester - dvs. Den har høy følsomhet, spesifisitet og enkel implementering.

    På grunn av at HCV vedvarer i blodet hos pasienter med akutt og kronisk hepatitt C samtidig med anti-HCV, fokuserte utviklerne av diagnostiske legemidler på utvikling av testsystemer for å detektere antistoffer som gir den mest fullstendige gjenkjenning av bærere av viruset og den tidligste diagnosen av akutt infeksjon. Variasjonen av antigener og antigeniske determinanter kodet av strukturelle og ikke-strukturelle soner av HCV RNA har bestemt retningen i utformingen av diagnostiske produkter ved å velge og arrangere oligopeptidene som brukes til å lage dem. I løpet av tiden som har gått siden oppdagelsen av HCV, er det blitt opprettet diagnostiske systemer av tre generasjoner (tabell 1).

    Tabell 1
    Diagnostiske preparater for å oppdage anti-HCV [9]

    Brukte peptider
    soner av HCV RNA i hvilke
    de er kodet

    % carrier detection
    HCV

    Første gang
    deteksjon
    anti-HCV fra
    start gulsott

    5-1-1 NS3
    C100-3 NS4

    C22-3 Core
    C200 NS3 og NS4
    SZZs NS3
    Fra 100-3 NS4

    C22-3 Core
    C200 NS3 og NS4
    SZZs NS3
    Peptid NS5

    Innføringen av ytterligere peptider, hovedsakelig c22-3 (Core), til diagnostiske preparater av 2. og 3. generasjon, fikk lov til å løse hovedproblemet, det vil si å øke følsomheten, spesifisiteten og, viktigst, detekterbarheten av anti-HCV. Takket være 3. generasjons diagnostikk kan opptil 97% av HCV-bærere oppdages. Samtidig ble en bestemt diskusjon forårsaket av beslutningen om å introdusere i det diagnostiske peptid kodet av NS5-regionen av HCV RNA. Ifølge enkelte forskere er nærværet av dette peptidet ikke kritisk for å forbedre kvaliteten på et diagnostisk legemiddel. [10,11]. Imidlertid kan antistoffer mot NS5 påvises tidligere i infeksjonen, noe som forbedrer kvaliteten på laboratoriediagnosen av akutt hepatitt C. [12].

    Foreløpig over hele verden, inkludert Russland, brukes tredje generasjons diagnostiske produkter. Peptidene som anvendes i diagnostiske preparater oppnådd ved rekombinant teknologi (f.eks diagnostiske selskaper: "Diagnostiske midler", Nizhny Novgorod, "vektor", Novosibirsk, "Roche", "Abbott" et al.), Eller syntetiske ( 000 MTS "Avicenna", St. Petersburg, "Organon", etc.). Diagnostika, hvor begge typer peptider ble brukt samtidig, ble betegnet som 4. generasjons legemidler. Ifølge deres egenskaper har disse stoffene ikke betydelige forskjeller. Sammenligningstester som ble utført regelmessig av Ruslands helsedepartement, demonstrerte den sammenlignbare sensitiviteten til diagnostiske produkter fra innenlandske og utenlandske produsenter.

    Det er blitt fastslått at bruken av 3. generasjons diagnostikk for å oppdage anti-HCV blant immunokompetente populasjoner (for eksempel bloddonorer) er estimert til 98,8-100%. Samtidig er blant disse immunkompromitterte individer, som pasienter etter transplantasjon av nyre, benmarg eller personer som er smittet med HIV, betydelig lavere - 50 - 95% [12]. S. George et al. [13] viste at hos 8,4% av pasientene med HIV-infeksjon, registreres falsk-negative resultater av anti-HCV-deteksjon. Videre kan hos slike pasienter en seroreversjonseffekt registreres under observasjonen, dvs. registrering av et positivt resultat etter en seronegativ anti-HCV-periode [14].

    En av de viktigste problemene ved å utføre forskning på forekomsten av anti-HCV er falske positive resultater. Deres utseende kan skyldes ikke-spesifikk interaksjon av reaksjonskomponenter, mulige kryssreaksjoner med andre virale antigener og mange andre faktorer. Nivået på falske positive resultater i deteksjon av anti-HCV med ulike diagnostiske legemidler kan nå 10-20% [15,16]. Et økt nivå av slike resultater ble observert blant pasienter med onkologiske og autoimmune sykdommer, personer med immunodefekter og pasienter med syfilis [16,17]. Eksistensen av falske positive resultater konfronterer laboratoriearbeideren med oppgaven å skille dem fra den virkelige gjenkjenningen av anti-HCV. For å løse dette problemet er deteksjon av serum HCV RNA i en blodprøve. Imidlertid foreslår det negative resultatet av deteksjon av HCV RNA ikke tilstedeværelsen av falsk positiv påvisning av anti-HCV. Det må tas i betraktning at anti-HCV kan sirkulere i isolasjon i blodet til en pasient som har gjenopprettet fra akutt hepatitt C (10-15%) eller som har eliminert HCV RNA som følge av terapi.

    BEKRÆFTELSE (SUPPLERENDE) TEST. Ytterligere (Supplement) tester er utviklet for å skille mellom falske positive prøver og prøver som faktisk inneholder antistoffer mot HCV. Oftest i disse testene brukes immunoblotprinsippet [for eksempel RIBA-testen ("Ortho-Clinical Diagnostics"); "LiaTek HCV" (Organon Teknika)] ​​når antigener kodet av forskjellige soner av HCV RNA blir adsorbert på en nitrocellulosemembran på en nitrocellulosemembran. Anti-HCV interagerer med adsorberte antigener ved bruk av enzymmerkede antistoffer mot humant Ig G og deres påfølgende påvisning ved bruk av et substratkompleks. I tillegg immunoblot, så vel som ytterligere tester for å bruke diagnostiske midler til påvisning av anti-HCV mot spesifikke antigener kodet av de forskjellige soner av HCV RNA [ "Spectrum 4" ( "ImBio" Nizhni Novgorod, RecombiBest ANTI-HCV-SPECTRUM "- OOO" Vector Best ", Novosibirsk; ELISA- Anti-NSU-Spectr, NPO" Diagnostiske systemer ", Nizhny Novgorod].

    Utviklingen og gjennomføringen av disse testene går hånd i hånd med innføring av screeningstester for å oppdage anti-HCV, og gjentar prinsippet om det utvidende spektrum av peptider som brukes i hver påfølgende generasjon av diagnostiske produkter. Dermed varierer diagnostisk RIBA-III fra den foregående generasjon ved tilsetning av et peptid kodet av NS5-sonen. Prinsipper for å bekrefte positive resultat av påvisning av anti-HCV primært omfatter: den mulighet (i visse tilfeller) mer presise resultater av den enzymatiske reaksjonen ved omsetning med individuelle peptider, så vel som bruk i et spredt spektrum DIAGNOSTICUM peptider som ikke benyttes i screeningsanalyser. Bare introduksjonen av nye peptider kan øke den diagnostiske verdien av bekreftende tester.

    Tolkningen av de oppnådde resultatene, for eksempel i en test som RIBA-III, inneholder tre mulige svar: et positivt, et negativt og et usikkert resultat. Den siste av dem er utstedt ved mangel på klare indikasjoner (i henhold til instruksjonene som er vedlagt diagnostikksettet), slik at du definitivt kan dømme tilstedeværelsen eller fraværet av anti-HCV i prøven under studien. Forholdet mellom spekteret av registrerte responser ved gjennomføring av bekreftende tester varierer avhengig av egenskapene hos grupper av pasienter der anti-HCV primært oppdages [18]. Ifølge J.M. Pawlotsky et al. [19], i halvparten av resultatene behandlet som "uspesifisert", er det mulig å detektere HCV RNA. Etter vår mening legitimiteten til svar - "udefinert resultat påvisning av anti-HCV", utgitt av laboratoriepersonalet kliniker, tydelig ikke bare i den bekreftende test, og rutinemessige undersøkelser for tilstedeværelse av anti-HCV. Behovet for en slik tolkning av resultatene er en refleksjon av den nåværende tilstanden for laboratoriediagnose av hepatitt C.

    Bestemmelse av IgM ANTI-HCV. For tiden er det blitt opprettet diagnostiske kits for påvisning av IgM anti-HCV av bedrifter, og blir kommersielt produsert: "Vector Best"; "Diagnostiske systemer"; Imbio, Abbott og andre. I designfasen av diagnostiske sett ble ELISA-sett opprettet, basert på peptider kodet av forskjellige regioner av HCV RNA [20]. Valget ble gjort på et peptid kodet av Core-regionen av HCV RNA og deteksjon av IgM-antistoffer mot det. Som ved bruk av tester for å oppdage anti-HCV (IgG), kan falske positive resultater registreres i IgM anti-HCV testen. Ifølge Stevensona D.L. et al. [21] hadde opptil 70% av pasientene med kronisk hepatitt C med tilstedeværelse av anti-HCV IgM samtidig økt nivå av reumatoid faktor, noe som bidrar til utseendet på falske positive resultater. Imidlertid, ifølge Pawlotsky J.M., påvirker nærværet av reumatoid faktor ikke kvaliteten på deteksjon av IgM anti-HCV [22].

    BESTEMMELSE AV HCV-ANTIGENSER. Evnen til å oppdage HCV-antigener tiltrukket oppmerksomheten til forskerne umiddelbart etter oppdagelsen av viruset. Den viktigste muligheten for testingen ble demonstrert av K. Krawczynski et al. [23], som immunohistokemisk oppdaget HCV-antigener i leveren vev, som viste spesifikiteten til immunfluorescerende glød. Anvendelsen av poly- og monoklonale antistoffer til forskjellige HCV-antigener har etablert tilstedeværelse av HCV kjerne Ag, antigener kodet NS3 og NS4 soner HCV RNA i kjernen og cytoplasmaet i hepatocytter, i 60-90% av pasientene med kronisk HS [24].Imidlertid videre studier har vist at HCV antigener kan detekteres i mindre enn 5% leverceller.

    De første diagnostiske test-systemer ( "Ortho antistoff mot kjerne antigen (monoklonalt) EL1SA Test System" og "Imucheck F-HCV Ag kjerne Kokusai") for påvisning av HCV-antigen dukket opp på markedet av immunologiske produkter i 1999. Målet for deteksjon var kjerneantigenet av HCV, som bestemmes ved anvendelse av en fast fase ELISA-variant utformet på grunnlag av monoklonale antistoffer. De første studiene om bruk av disse testene bestemte deres høye følsomhet, spesifisitet og muligheter for anvendelse, hovedsakelig i blodtransfusjonstjenesten [25,26]. etablert:

  • evnen til å bestemme Core Ag HCV i serum eller plasma;
  • spesifisitet av deteksjon av Core Ag HCV;
  • Tilstedeværelsen av personer med sirkulerende antigen i blodet seronegative for anti-HCV;
  • hyppig (90,3%) påvisning av Core Ag HCV i serum med tilstedeværelse av anti-HCV og HCV RNA [25];
  • direkte korrelasjon mellom konsentrasjonen av HCV RNA og påvisning av Core Ag HCV [25];
  • sammentrekningen av "vinduet" -fasen - fra smittepunktet til det første positive resultatet av deteksjon av anti-HCV. Det ble bestemt at Core Ag HCV kan detekteres i 83% tilfeller (n = 24) neste dag etter den første detektering av HCV RNA [26] og lang (26 dager i gjennomsnitt) før forekomsten av anti-HCV [27].

    METODER TIL DETEKSJON AV HCV RNA. Den moderne fasen av laboratoriediagnose av hepatitt C kan karakteriseres som begynnelsen av den omfattende utbredelsen av molekylærbiologiske metoder for å detektere HCV RNA. Det store flertallet av nukleinsyre-deteksjonsmetoder har blitt testet for å detektere HCV RNA. En betydelig mengde litteratur vurderinger publisert både på russisk [28] og utenlandske publikasjoner [29] er viet prinsippene for å designe diagnostiske produkter og deres bruk for påvisning av viralt DNA eller RNA. Alle disse metodene kan deles inn i to grupper, som er basert på anvendelse av hybridiseringsprinsippene uten amplifisering av den valgte delen av nukleinsyre eller med deres amplifikasjon, som kan øke oppløsningen av metoden signifikant.

    Metoden for hybridisering er basert på kombinasjonen av merkede hybridiseringsprober (gentekniske eller syntetiske molekylære strukturer som inneholder nukleotidsekvenser som er komplementære til utvalgte deler av RNA). Analyse av resultater utføres i henhold til intensiteten av signalet som kommer fra etiketten i sammensetningen av det dannede komplekset.

    I hepatitt C er denne metoden for å påvise HCV RNA primært blitt brukt til å identifisere den direkte i hepatocytter, og i tester referert til som in situ hibidisering [30]. Muligheten for direkte deteksjon av HCV RNA i vev gjorde det mulig å oppdage det i mononukleære blodceller, spyttkjertelceller og andre vev i kroppen til en pasient med hepatitt C [31,32].

    Hybridiseringsmetoden som brukes for påvisning av HCV RNA gjør det mulig å demonstrere tilstedeværelsen av negative (replikative) kjeder av HCV RNA, hvilket indikerer en aktiv replikasjon av viruset [33].

    Polymerasekjedereaksjonsmetoden er for tiden den mest brukte metodiske teknikken som ligger til grunn for nesten alle molekylære biologiske metoder for å detektere HCV RNA. Videre er bestemmelsen av HCV RNA mulig både i kvalitativ og kvantitativ form, noe som er spesielt viktig for utnevnelse, overvåking og evaluering av effektiviteten av den anvendte terapi.

    De viktigste varianter av metoden er:

  • polymerasekjedereaksjon (PCR);
  • ligasekjedereaksjon;
  • NASBA;
  • TMA (transkripsjons-mediert amplifikasjonsreaksjon, transkripsjons-mediert amplifisering).

    Polymerase kjede reaksjon er en mye brukt metode for gjenkjenning av HCV RNA, både i Russland og i utlandet. Den er basert på en multi-syklusprosess som ligner den naturlige replikasjonen av nukleinsyre, med hver syklus bestående av suksessive stadier.

    Fra det studerte materialet (serum eller blodplasma, leverbiopsi) isoleres HCV RNA. Med tanke på at HCV-nukleinsyren er representert ved RNA, og et cDNA-molekyl er nødvendig for amplifisering, ved bruk av enzym-revers transkriptase, oppstår dannelsen av enkeltstrengede HCV-cDNA-molekyler. I det neste trinnet er den såkalte "HCV" festet til en spesifikk del av hver av HCV-cDNA-kjedene. primrene er korte oligonukleotider komplementære til kjente nukleotidsekvenser. Sammenligning av den primære strukturen av 5'UTR-regionen i genomet av forskjellige HCV-isolater avslørte deres ubetydelige variabilitet (mellom genotyper, nukleotidhomologi - 92-98% og innenfor genotypen 98-99%). Dette gjorde det bedre å velge primere fra denne sonen av HCV RNA og deres bruk i diagnostiske testsystemer produsert i vårt land og i utlandet.

    Videre, ved hjelp av enzymet DNA-avhengig DNA-polymerase, oppstår syntesen av nye DNA-segmenter. For tiden brukes bakteriene Thermophilus termus (Tth polymerase) eller Thermophilus aquaticus (Taq polymerase) vanligvis som kilde til dette enzymet. Ved å ha termisk stabilitet i nærvær av mangan- og magnesiumioner kan dette enzymet samtidig brukes til å syntetisere komplementære enkeltstrengede HCV-cDNA-molekyler og amplifisere utvalgte cDNA-regioner. Ved sluttfasen av en syklus av reaksjonen, ved bruk av DNA-polymerase, finner en syntese av nye tråder av komplementære HCV-cDNA sted. Multiple repetisjon av reaksjonssyklusene fører til akkumulering av HCV-cDNA-fragmenter, som kan registreres ved anvendelse av polyakrylamidgelelektroforese etterfulgt av visuell deteksjon eller bruk av hybridisering med oligonukleotidprober, som øker sensitiviteten og spesifisiteten til de diagnostiske produktene som anvendes. Bruken av primere merket med enzymer muliggjør opptak av PCR-resultater ved bruk av enzymimmunoassay.

    Et konstant mål for forskere som designer diagnostiske systemer for å oppdage HCV RNA, er å øke følsomheten og spesifisiteten. Dette målet blir betjent av en PCR-variant, betegnet "nestet PCR" (nestet PCR) [34]. Et karakteristisk trekk ved denne metoden fra "klassisk" er samtidig bruk av to par primere, hvorav den ene er komplementær til den indre delen av amplikonet oppnådd etter den første amplifikasjonsrunde. Samtidig antas det at med denne PCR-varianten er det en høyere risiko for forurensning av prøvene, noe som kan føre til falske positive resultater [35].

    Det akutte behovet for bestemmelse av HCV-RNA og vanskelighetene forbundet med storskala produksjon av svært følsomme og spesifikke diagnostiske sett for PCR-diagnostikk, har bestemt utbredt anvendelse av preparater i vitenskapelige laboratorier. Sammenligning av disse testsystemene, de såkalte "hjemme" -testene ("in house tests") viste deres høye variabilitet i følsomhet og spesifisitet, samt mangel på reproduserbarhet av resultater mellom laboratorier og en rekke diagnostiske produkter. Således var det kun 22 (16%) som kunne bestemme tilstedeværelsen eller fraværet av viralt RNA i de angitte kontrollprøver [36] når man utførte den første europeiske syklusen "ekstern" kvalitetskontroll for å detektere HCV RNA (1996) fra 136 laboratorier. Et lignende resultat ble notert i vårt land under lignende arbeid under det føderale systemet for ekstern kvalitetskontroll (2001), da bare 14 (14,4%) av 14 deltakende laboratorier kunne løse oppgaven [37].

    Årsakene til utseendet på falsk-negative og falsk-positive resultater av HCV RNA-deteksjon er forskjellige. For falske negative resultater:
    - tap eller ødeleggelse av HCV RNA som forberedelse til respons av klinisk materiale;
    - Tilstedeværelsen i prøven av inhibitorer som påvirker de forskjellige komponentene i PCR. Disse inhibitorene er representert av forskjellige kjemiske eller proteinstoffer. For eksempel: Tilstedeværelsen i spermevæsken av revers transkriptasehemmere tillot ikke å detektere HCV RNA og snakker om muligheten for å realisere seksuell overføring av hepatitt C [38]; tilstedeværelsen av hepaprine [39]; høye nivåer av serumkryoglobulin [40];
    - manglende overholdelse av termisk lagring og transport av klinisk materiale. For falske positive resultater:
    - forurensning mellom prøver (ved behandling av prøver og / eller arbeid med reaksjonsblandingen), inkludert forurensning med en positiv kontrollprøve;
    - forurensning med forforsterkningsprodukter (amplikoner) som kan forurense testprøvene og løsningene gjennom aerosoler eller laboratorieutstyr.

    Den massive introduksjonen av PCR-diagnostikk per definisjon av HCV RNA har satt opp til overgang til et nytt nivå av laboratorieundersøkelse for helsevesenet. Isolering av isolerte soner for gjennomføring av hovedstadier av PCR (for prøveforberedelse; amplifikasjon; å ta hensyn til de oppnådde resultatene); et separat sett for hvert trinn i reaksjonslaboratoriet klær, automatiske pipetter; eksistensen av standard diagnostiske sett og, viktigst, reduserer forekomsten av falske resultater tilstedeværelsen av høyt kvalifisert laboratoriepersonell.

    Det første standardiserte kit for å bestemme HCV RNA ("Amplicor ™ HCV", "Roche Diagnostic Systems") ble produsert i 1993. I løpet av årene har HCV RNA-sett utviklet seg, hovedformålet var å øke sensitiviteten og spesifisiteten. Ved utforming av Amplicor TM HCV ble flere originale metoder brukt til å identifisere 100 eller flere kopier av HCV RNA per ml. I tillegg til å håndtere mulige tilfeller av forurensning av prøver og løsninger som brukes i settet. Bruken av enzymet - amperses og deixiuridintrifosfat (dUTP) gjør det mulig å ødelegge de forrige aplikonene i den første forløpssyklusen, med hvilken forurensning kan forekomme. Ødeleggelsen av amplifikasjonen ved slutten av den første amplifikasjons syklusen (ved +55 ° C) tillater ikke enzymet å ødelegge amplikoner valgt som mål. Hovedinnovasjonen var innføring av internkontroll. Betydningen av denne innovasjonen ligger i innføringen av en sekvens som ligner den amplifiserte regionen av HCV RNA i hver testprøve, som deretter påvises ved å bruke de tilsvarende primere i amplifikasjonsreaksjonen i en lignende modus. Fraværet av en positiv reaksjon ved påvisning av intern kontroll indikerer tilstedeværelsen av et falsk-negativt resultat av reaksjonen på nærværet av HCV RNA i prøven under studien. Den neste generasjonen ble diagnostisert med legemidlet, betegnet "HCV Amplicor 2.0", som ved bruk har en sensitivitetsgrense for 50 HCV RNA-molekyler.

    Systemet for å detektere HCV RNA ved hjelp av Roche-sett kan ikke betraktes isolert fra deres instrumentering, som bestemmer den høye kvaliteten på testingen. Utviklerne av metoden søkte å automatisere alle trinn i reaksjonen. Utførelsen av denne ideen var "COBASAmpliPrepTM" -systemet, som lar deg fullstendig automatisere prosessen med å isolere HCV RNA, amplifikasjon og deteksjon, og dermed redusere risikoen for falsk positive og falsk-negative resultater, samtidig som du opprettholder høy følsomhet og spesifisitet [41].

    Ligase kjede reaksjon for påvisning av HHC RNA. (LCR). Metoden er basert på evne til enzymet "DNA-avhengig DNA-ligase" for å syke (ligate) pausene av fosfodiesterbindingen i DNA i nærvær av ATP og Mg2 + -ioner. Som med "klassisk" PCR for påvisning av HCV RNA, er den første fasen av LCR revers transkripsjon for å produsere HCV cDNA. Videre binder DNA-ligasen to primerpar (komplementær til den 5'-ukodede sonen av HCV RNA), som videre amplifiseres. Påvisning av LCR-amplifikasjonsprodukter utføres ved å ta hensyn til reaksjonen av antigen-antistoff. Hver av de to primrene er merket med en annen hapten. Den første av disse er fanget av antistoffer adsorbert på mikropartiklene. Etter vaskeprosedyren ved bruk av et andre par antistoffer merket med en fluorescerende label, er de selektivt interaksjon med haptenet i amplifikasjonsproduktet, etterfulgt av en substratreaksjon og telling på et fluorimeter.

    Sensitiviteten til denne metoden er ca. 200 kopier av HCV RNA per ml, noe som gjør det mulig å løse ulike kliniske diagnostiske problemer [42]. For tiden er diagnostiske sett for å påvise HCV RNA basert på LCR produsert av Abbott.

    Nukleinsyre-sequensforsterkning - NASBA-metode for påvisning av HCV-RNA er basert på samtidig virkning av tre enzymer: aviær myeloblastom revers transkriptase, avian RNAase og T7 RNA polymerase [43.]. I motsetning til RT PCR reverserer ikke det første trinnet transkripsjon av HCV RNA. Ved bruk av de anvendte enzymene kan mer enn 10 (9) kopier av HCV cDNA-regionen oppnås innen 90 minutter [44]. Muligheten for å utføre reaksjonen ved lave temperaturer (+41 C) forenkler arbeidet sterkt og eliminerer behovet for utstyr som gir sykliske endringer i høye temperaturer. Rekord av resultatene av reaksjonen utføres under anvendelse av elektrokemiluminescens. Til tross for at NASBA er nær RT PCR i følsomhet, er metoden ikke mye brukt til å detektere HCV RNA. For tiden utvikles en variant av metoden som kombinerer prinsippene for NASBA og "Real-time RT PCR".

    Den transkripsjonsmidlede amplifikasjonsmetoden (TMA) er forskjellig fra PCR og LCR, hovedsakelig fordi den direkte amplifiserer fragmenter av HCV RNA og ikke HCV cDNA. Ved den første fase av reaksjonen er en primer (nr. 1) festet til HCV RNA og en kopi av målmolekylet, cDNA, syntetiseres ved å bruke et enzym (revers transkriptase). Omvendt transkriptase, som også har aktiviteten til RNase-H, ødelegger viralt RNA i et hybrid RNA-cDNA. Deretter er en andre primer festet til cDNA-molekylet, etterfulgt av fullføring av dobbeltstrenget DNA ved bruk av revers transkriptase. Ved hjelp av en annen β-RNA-polymerase, transkriberes RNA fra cDNA, som fører til dannelsen av 100 til 1000 kopier av amplikonet HCV RNA i en reaksjonscyklus. Primer nr. 2 er festet til disse RNA-apliconene med videre syntese av cDNA-kopier og ødeleggelse av RNA-molekylet. Vedlegg av primer nr. 1 til cDNA etterfulgt av fullføring av dobbeltstrenget DNA utløser neste amplifikasjons syklus. Opptak av resultatene av reaksjonen utføres på et lumenometer, siden de resulterende RNA-amplikoner interagerer spesifikt med DNA-prober merket med kjemiluminer.

    Som fordeler ved TMA-metoden ved detektering av HCV RNA, er det bemerket:

  • utfører reaksjonen ved lavere temperaturer sammenlignet med PCR;
  • dannelsen av et større antall amplikoner i en reaksjonssyklus, noe som reduserer tiden som kreves for å oppnå sluttresultatet (30-40 minutter) og øker følsomheten av reaksjonen (50 kopier / ml) [45].
  • reduserer risikoen for forurensning, siden RNA er mindre stabil enn DNA.

    Sammenligningsstudier på påvisning av HCV RNA ved bruk av TMA og andre metoder har vist et høyt tilfeldighetsfall av resultater [45].

    En kombinasjon av hybridiserings- og amplifikasjonsprinsippene ligger under metoden for å detektere HCV-RNA, betegnet som "hybridiseringsmetode ved bruk av forgrenede prober eller merket DNA-analyse (bDNA) [46]. I motsetning til PCR forsterker denne testen ikke HCV-cDNA-molekylene, men signalet. Reaksjonen utføres i 96-brønnsplater hvor HCV-RNA-fragmenter fra den 5'-utranslaterte sone og HCV-RNA-kjernegenet blir adsorbert på grunn av påfølgende binding til et syntetisk forgrenet DNA-molekyl og hybridisering med en prøve merket med alkalisk fosfotase med En kraftig økning i mottatt signal oppnås med en forsterker og påfølgende enzymatisk reaksjon. For øyeblikket har tredje generasjons diagnostiske sykdommer vist seg på det diagnostiske markedet (Vaueg 3.0 Hepati-Tis C Virus RNA), som har sensitiviteten til å detektere 520 IE / ml (2500 kopier av HCV RNA).

    KVANTITATIV DETEKSJON AV HCV RNA. For å vurdere konsentrasjonen av HCV RNA benyttet kvantitativ versjon av PCR. I utgangspunktet ble konsentrasjonen av HCV RNA karakterisert ved ordinære verdier, slik som "+", "++", etc., visuelt reflekterende intensiteten av bånd oppnådd ved elektroforese av amplifikasjonsprodukter, eller ved sluttfortynningsfremgangsmåten, dvs. ved nærvær av et positivt resultat i finalen titreringspunkt. Vanskelighetene med å standardisere alle stadier av PCR tillater ikke en objektiv vurdering av konsentrasjonen av HCV RNA, noe som fører til signifikante feil i tolkningen av de oppnådde resultatene.

    Foreløpig blir resultatene av studien uttrykt i kvantitative enheter: Antall kopier av HCV RNA inneholdt i 1 ml. I absolutte eller logaritmiske termer (log 10). Basert på det faktum at konsentrasjonen av detektert HCV RNA reflekterer antall virale partikler, betegnes denne indikatoren som "viral ekvivalent (ekv)", med tillegg av prefikset k (kilo, tusen) eller M (millioner). En annen måte å uttrykke mengden av virale partikler på er deres vektekvivalenter. For eksempel, i gram eller piktogrammer (1 pg tilsvarer ca. 1 million eq). Mangfoldet av verdier som brukes, gjør det vanskelig å tolke resultatene oppnådd i ulike laboratorier. Derfor har WHOs ekspertkomite for biologisk standardisering produsert en "internasjonal standardprøve" som inneholder HCV RNA (frysetørket serum som inneholder HCV RNA av den første genotypen), konsentrasjonen av disse er uttrykt i internasjonale enheter (IE / mL) [47]. Spesielle koeffisienter gir deg mulighet til å beregne de oppnådde konsentrasjonsindikatorene i internasjonale enheter.

    Nesten alle PCR-varianter brukes til å bestemme konsentrasjonen av HCV RNA. I dette tilfelle pålegges en rekke spesifikke krav på diagnostiske preparater, hvorav det viktigste er den strenge lineariteten av resultatene, dvs. en økning i signalet av den registrerte reaksjonen med en økning i konsentrasjonen av HCV RNA i prøven under studien. Bruk av interne standarder med forskjellige nivåer av HCV RNA gjør at vi kan unngå mange metodologiske feil som kan påvirke reaksjonsresultatet [28]. Følsomheten til den anvendte diagnosen (Amplicor HCV Monitor v2.0; LCx HCV RNA Quantitative Assay) gjør det mulig å oppdage HCV RNA ved å starte ved 50 kopier per ml [48,49], noe som er spesielt viktig for å forutsi effektiviteten av valgt antiviral terapi.

    Real-time PCR ("Real-time RT PCR") er et av de mest lovende alternativene for en kvantitativ metode for å oppdage HCV RNA. Metoden og maskinvaren er i fellesskap utviklet av spesialister fra Roche og Percin Elmer. Prinsippet med fremgangsmåten er evnen til å hydrolysere cDNA-sekvenser i retning av 5 '---- 3'. Reaksjonen bruker en spesiell sonde merket med to fluorescerende fargestoffer som har lignende absorpsjons- og fluorescensmaksima. I nærvær av amplifikasjonsprodukter spalter Tagpolymerase sonden, som forhindrer overføring av energi fra ett fargestoffmolekyl til et annet, og forhindrer dermed frigjøring av et kvantum av lys. Et spesielt instrument registrerer reaksjon og matematisk modellering av fluorescenskinetikken ved hvert trinn av reaksjonen, som tillater oppnåelse av informasjon om den opprinnelige konsentrasjon av HCV RNA.

    Et karakteristisk trekk ved "sanntids-PCR" er evnen til å oppnå informasjon om forekomsten av HCV RNA direkte i reaksjonsprosessen, noe som gjør det mulig å redusere analysetiden i kombinasjon med høy følsomhet og linearitet av resultatene [50]. Ifølge Tatyana Yashina og medforfattere kan denne metoden oppdage 200 kopier av HCV RNA per ml. [51].

    METODER FOR GENOTYPING HCV RNA. Definisjonen av HCV tilhørende en bestemt genotype og subtype har blitt anvendt for å løse ikke bare rent vitenskapelige, men også praktiske problemer. For eksempel: søker etter infeksjonskilden under utbrudd av hepatitt C eller forutsi effekten av den brukte terapien.

    Gullstandarden for HCV-genotyping er den direkte bestemmelse av den primære strukturen av HCV RNA med den etterfølgende fylogenetiske analysen [52], som gjør det mulig å tydelig karakterisere dette virusisolatet. Denne informasjonen kan fås ved hjelp av følgende sekvenseringsalternativer:

  • direkte;
  • basert på standard kloning;
  • sekvensering av PCR-reaksjonsprodukter (begrenset sekvensering).
    Til tross for nøyaktigheten av resultatet, er den direkte sekvenseringsmetoden ikke brukt i praktisk helsetjenester på grunn av de tekniske vanskelighetene i studien og de høye kostnadene ved arbeidet. Samtidig er tilgjengeligheten av informasjon om den primære strukturen til HCV RNA en referansemetode for genotyping, og tilgjengeligheten av instrumenter for automatisk sekvensering forenkler oppnåelse av resultatet.

    For tiden brukes i de fleste tilfeller metoder basert på bruk av PCR med typespesifikke primere for genotyping av HCV RNA. For første gang ble genotyping av HCV RNA utført av N. Okamoto og medforfattere i 1992 ved bruk av RT-PCR [53], som inkluderer to amplifikasjonstrinn. Den første av dem ble utført med universelle, for alle HCV-genotyper, primere, den andre med en blanding av typespesifikke primere med å oppnå spesifikke amplifikasjonsprodukter av forskjellige lengder. Tilstedeværelsen av en bestemt genotype ble dømt av størrelsen på det amplifiserte produktet. Som primere brukes typespesifikke sonder, hvor informasjonen ligger i 5'UTR, Core eller NS5 - RNVGS-regioner [54].

    Hybridisering av amplifiserte produkter med adsorberte genspesifikke prober (fra den 5'-ikke-translaterte sone av HCV RNA) adsorbert på nitrocellulosemembranen ligger under testen "INNO-LiPA HCV, INNO-GENETICS" [55]. Ved å bruke denne testen var det først mulig å skrive genotyper: la; lb; 2a; 2b; 3a; 3; 4 og 5a. I fremtiden gir testsystemene til 2. generasjon "INNO-LiPA HCV II, INNOGENETICS" oss mulighet til å skille alle 6 genotyper og i tillegg 2c; 2d; 2i; 3c; 4a-h; 6a og 10a. [56]

    Metodisk arsenal for å bestemme HCV-genotyper er ikke begrenset til de ovennevnte metodene og inkluderer forskjellige metoder:

  • genotyping basert på analyse av forsterkede profiler for forsterkede produkter (RFLP). Amplifikasjonsprodukter av HCV RNA-fragmenter (5'UTR- eller NS5-regionen av HCV-RNA) spaltes av restriksjonsenzymer. De resulterende fragmentene varierer i lengde avhengig av restriksjonene i dem, som er spaltet. Resultatene av elektroforese og deres sammenligning tillater oss å identifisere HCV-genotypen i prøven under studien [57]. Sammenligning av resultatene av genotyping med PCR-RFLP med datasekvensering viste høy grad av tilfeldighet av resultater - 95% [58].
  • genotyping basert på SSCP-metoden (evaluering av konformasjonspolymorfismen av enkeltstrengede DNA-fragmenter). Den 5'-ikke-translaterte regionen av HCV RNA, som har et minimalt sett av nukleotidvariasjoner som skiller genotyper fra hverandre, ble valgt som studieobjekt. Dette faktum bestemmer muligheten for å anvende vanlige primere under genotyping [59].

    SEROTYPING Anti-HCV ble gjort mulig ved studier av P.Simmonds og medforfattere som etablerte tilstedeværelsen av antistoffer rettet mot genotype-spesifikke epitoper, informasjon om hvilke kodes av NS4-regionen i HCV RNA [60]. Ved hjelp av diagnostikk for ELISA, konstruert på grunnlag av syntetiske peptider, var det mulig å skille mellom tilfeller av hepatitt C forårsaket av virus 1, 2 og 3 genotyper (89% samsvar med resultatene av genotyping). Utviklingen av testsystemer som bruker syntetiske og rekombinante antigener kodet av NS4 og Core-soner av HCV RNA, tillot oss å utvide listen over typer virusvarianter, samt å dømme tilstedeværelsen av subtyper (1a, Ib, 2a, 2b, 3a, 4a) [61,62]. For tiden utføres kommersiell produksjon av diagnostiske produkter for serotyping i spotversjonen av ELISA - "Murekh NA 1-6 Serotyping Assay, Murex Diagnostics", og i varianten "immunoblot" - RIBA HCV Serotyping Assay, Chiron Diagnostics. Sammenligningsdata for resultatene av serotyping og genotyping av HCV-RNA viste et høyt tilfeldighetsfall, og oppnådde 95% [62].

    Serotyping av anti-HCV sammenlignet med genotyping av HCV RNA har fordeler som lett reaksjon og lavere kostnad. Samtidig kan denne metoden på ingen måte erstatte genotyping. Resultatene av serotyping av anti-HCV indikerer typen anti-HCV med nåværende eller tidligere infeksjoner. I enkelte tilfeller (oftest hos pasienter med hemofili) registreres samtidig påvisning av anti-HCV av forskjellige subtyper, noe som kan indikere flere infeksjoner med forskjellige subtyper og HCV-genotyper [63]. I tillegg kan RNA hos pasienter med hepatitt C mot bakgrunn av en uttalt immunbrist tilstand være den eneste markøren som gjør det umulig å utføre serotyping.

    IDENTIFIKASJON OG BEHANDLING AV TESTRESULTATER AV HCV SEROLOGISKE MARKERE INFEKSJON. Tilstedeværelsen av et bredt spekter av serologiske markører av nåværende eller tidligere HCV-infeksjon, samt et moderne metodologisk grunnlag, tillater å løse mange problemer med laboratoriediagnose og forebygging av hepatitt C. Tabell 2 viser de serologiske markørene for HCV-infeksjon og de viktigste områdene av testen deres.

    Tabell 2
    Diagnostisk betydning av markører av nåværende eller tidligere HCV-infeksjon

    screening
    i tjeneste
    av blod

    bekreftet
    LØFTER
    resultat
    + anti-HCV

    En av hovedoppgavene til laboratoriediagnose av hepatitt C er å diagnostisere og skille akutt fra kronisk hepatitt C ved å identifisere serologiske markører for infeksjon. Som med annen akutt viral hepatitt, serologiske markører av HCV-infeksjon vises konsekvent og forsvinner i løpet av infeksjon og helingsprosessen (figur 2).

    HCV RNA kan detekteres på dagene 7-21 etter infeksjon med HCV og anti-HCV på dagene 20-150 (i gjennomsnitt 50 dager) [64]. Spekteret av anti-HCV kan variere avhengig av perioden med akutt hepatitt. Det antas at den første til å kunne identifisere antistoffer kodet av Core og NS5 sonene av HCV RNA. Anti-HCV til proteiner kodet av NS4-sonen er fraværende i den akutte fasen av hepatitt C [65]. En komparativ studie av nivået av konsentrasjoner av anti-HCV, spekteret av anti-HCV og HCV RNA hos pasienter med akutt og kronisk hepatitt viste noen forskjeller [66]. Etter vår mening kan disse forskjellene være knyttet til de individuelle egenskapene til den smittsomme prosessen, noe som reduserer deres diagnostiske verdi.

    Fig. 2. Akutt hepatitt C

    I analogi med laboratoriediagnostikk av hepatitt A og B ble det forventet at bestemmelsen av antistoffer mot HCV-klasse IgM ville ha så mye diagnostisk verdi som IgM anti-HAV og IgM anti-HBc. Testdata fra serum hos pasienter med akutt og kronisk hepatitt C for tilstedeværelse av anti-HCV IgM indikerer imidlertid at de ofte finnes hos disse pasientene - henholdsvis 50-93% og 50-70% [67,68], disse resultatene indikerer at deteksjon av IgM anti - HCV kan ikke brukes som markør for akutt HCV-infeksjon.

    Fraværet av en markør som hevder rollen som den "gyldne" standarden for akutt hepatitt C, bestemmer behovet for en omfattende vurdering av de oppnådde resultatene, basert på dynamisk observasjon av pasienten.

    Ikke mindre viktig retning ved bruk av svært følsomme metoder for testing av HCV RNA reduserer risikoen for utvikling av posttransfusjons hepatitt C. Behovet for slikt arbeid bestemmes av nærværet av "vinduet" -fasen, dvs. tiden mellom den første detektering av HCV-RNA og utseendet av anti-HCV, samt eksistensen av blodgivere (pasienter med kronisk hepatitt C) som har HCV-RNA i fravær av anti-HCV. Det nåværende systemet for overvåking av donert blod for HCV inkluderer bare anti-HCV testing, og risikoen for infeksjon med hepatitt C forblir. Basert på dette er spørsmålet om å teste blod for tilstedeværelse av HCV RNA ved hjelp av moderne metoder (NAT-metodene - "nukleinsyreampliseringstest") legitim. Faktoren som begrenser dette arbeidet er høye kostnader for forskning. For å redusere kostnadene anbefales det å teste bassenger av blodsera (fra 8 til 96 prøver) etterfulgt av et søk etter en positiv prøve ved detektering av HCV RNA i serabassenget. Når man tar hensyn til fortynningsfaktoren til det ønskede HCV RNA når man ser blodsera, blir spørsmålet om bruk av de mest sensitive deteksjonsmetoder avgjørende. Det antas at bruk av diagnostiske sett for NAT - med en følsomhet på 50-100 IE / ml kan redusere risikoen for hepatitt C etter transfusjonen.

    Utvilsomt er listen over problemer som kan løses ved testing av hele spektret av markører av HCV-infeksjon ikke begrenset til disse to områdene. Tilgjengeligheten av moderne testmetoder i kombinasjon med kunnskapen om deres evner åpner bred utsikt for vitenskapelig og anvendt arbeid på hepatitt C.


  • Flere Artikler Om Leveren

    Skrumplever

    Folkemidlene for behandling av levercyster

    Hver dag lider vår lever av påvirkning av uønskede faktorer: dårlig kosthold, alkohol, dårlig økologi, kontakt med giftige stoffer etc. Skadelige stoffer som kommer inn i kroppen, bryter med kjertelen, noe som truer farlige sykdommer.
    Skrumplever

    Hepatitt B og graviditet. Vaksinasjon og graviditet

    Gravide kvinner må testes for hepatitt B uten svikt. Det er en sannsynlighet for overføring av viruset til nyfødte under graviditet eller fødsel (vertikal overføring).